Avis de soutenance - doctorat - Marion LENGLET

La protéine von Hippel-Lindau (VHL), codée par le gène VHL constitué de 3 exons, est un facteur clé de la régulation de la voie de l'hypoxie dont l'acteur majeur est le facteur de transcription inductible en hypoxie (HIF). En présence d'oxygène, HIF est reconnue par VHL puis ubiquitinylée et dégradée via le protéasome. En absence d'oxygène, HIF est stabilisé et induit l'expression d'une centaine de gènes impliqués notamment dans l'angiogenèse (VEGF), la prolifération (TGF), le métabolisme (GLUT1) et l'érythropoïèse (EPO). Quand VHL est muté, HIF est n'est plus dégradé et entraine la surexpression de ces gènes qui peuvent conduire à la formation de tumeurs via l'hypervascularisation et l'hyperprolifération cellulaire ou à une érythropoïèse incontrôlée. Deux pathologies sont associées à des mutations de VHL. La polyglobulie, caractérisée par un taux de globules rouges sanguins et d'EPO élevés, a pour origine une mutation homozygote ou hétérozygote composite de VHL. La maladie de VHL, caractérisée par le développement de tumeurs hypervascularisées (hémangioblastomes du système nerveux central ou de la rétine, phéochromocytomes, paragangliomes ou cancers du rein), a pour origine une mutation hétérozygote de VHL associée à une perte d'hétérozygotie dans les tumeurs. Il a été mis en évidence que les mutations dans le gène VHL suivent un modèle d'oncogenèse en gradient : plus la perte de fonction de pVHL est importante, plus la pathologie développée est sévère. Cependant, certains patients présentent un tableau clinique caractéristique d'une anomalie VHL sans aucune mutation (maladie de VHL) ou seulement à l'état hétérozygote (polyglobulie). Les mécanismes moléculaires à l'origine de ces phénotypes n'étant pas encore compris, l'objectif de ma thèse s'est porté sur l'étude de mutations complexes de VHL, à savoir des mutations impactant l'épissage du gène. Une étude approfondie a été réalisée sur 12 familles : étude de ségrégation, analyse phylogénétique, tests minigènes, séquençage de l'ARN des tumeurs et lignées lymphoblastoides de patients, mesure de l'expression des ARNm et des protéines, études fonctionnelles des nouvelles isoformes VHL. L'épissage étant un mécanisme dépendant du type cellulaire, j'ai également participé au développement d'un modèle de cellules productrices d'EPO à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) de patients afin de réaliser des études adaptées. Le début de mon projet s'est porté sur l'étude de 2 mutations synonymes de l'exon 2 du gène VHL, à l'origine de la maladie de VHL ou d'une polyglobulie. J'ai pu mettre en évidence que ces mutations entrainent le saut de l'exon 2 dans les transcrits avec une diminution de l'isoforme sauvage (contenant les exons 1, 2 et 3) en faveur de celle contenant les exons 1 et 3, décrite comme non fonctionnelle. J'ai ainsi pu montrer que des mutations exoniques de VHL pouvaient être à l'origine de défauts d'épissage et entrainer une perte de fonction de VHL expliquant les phénotypes observés. L'étude approfondie des transcrits VHL m'a permis de mettre en évidence la présence de 2 exons cryptiques situés dans les introns 1 et 2. Ces 2 exons nommés E1' et E2' ont été séquencés et retrouvés mutés dans les cas inexpliqués de la maladie de VHL ou de polyglobulie. J'ai pu montrer que les mutations dans E1' conduisent à une rétention excessive de cet exon associée à une diminution de l'expression protéique totale de VHL. Dans les deux cas (saut de l'exon 2 ou rétention de E1'), l'impact sur l'épissage est plus important chez les patients avec tumeurs qu'avec une polyglobulie. L'analyse des mutations de E2' n'a pas encore permis de déterminer les mécanismes d'action en jeu. Lors de ma thèse, j'ai donc découvert une structure et une expression complexes du gène VHL. Mon travail a permis d'identifier l'origine de la pathologie chez des patients jusqu'ici sans diagnostic génétique, leur permettant un meilleur suivi médical et ouvrant sur de nouvelles pistes thérapeutiques.