Avis de soutenance - doctorat - Marion LEBLANC

S'il a d'abord été pensé que la complexité de l'être humain était due à un plus grand nombre de gènes codants par rapport aux autres espèces, nous savons aujourd'hui que c'est surtout une régulation plus complexe de l'expression des gènes qui en est à l'origine. Parmi les processus régulant l'expression des gènes se trouve l'épissage alternatif. En effet, il a été démontré que la règle "un gène - un ARNm - une protéine" est plus une exception qu'une règle et que plus de 95 % des gènes ont plus d'un transcrit d'ARNm chez l'homme, pouvant mener à la production de protéines issues du même gène mais aux fonctions et propriétés différentes. Cependant, l'étude de ces transcrits alternatifs est compliquée par la ressemblance entre les transcrits. De plus, elle a longtemps été limitée par les technologies de séquençage disponibles, en courts fragments, qui ne permettaient pas d'avoir une vision globale de la molécule d'ARN. Le récent avènement des technologies de séquençage en longs fragments a permis de surmonter cette limitation en permettant un séquençage de la molécule d'ARN dans son entièreté. Ce séquençage reste cependant indirect, dans la plupart des cas, car c'est la molécule d'ADNc, issue de la rétrotranscription de l'ARN, qui est séquencée. Dans le cadre de ce projet, j'ai étudié l'épissage alternatif des gènes impliqués dans les maladies des neurones moteurs et analysé l'expression cellule-spécifique des transcrits alternatifs de ces gènes. Pour cela, j'ai mis en place un protocole de séquençage indirect de l'ARN en longs fragments avec la technologie d'Oxford Nanopore Technologies. Le cDNA a été obtenu à partir de l'isolation et de la rétrotranscription d'ARN de fibroblastes (n=2), de cellules mononucléées du sang périphérique (n=3) et de neurones moteurs dérivés de cellules souches pluripotentes induites (n=3) humains provenant d'individus contrôles. La librairie de séquençage a ensuite été enrichie en fragments de grande taille afin de contrer le biais de taille du séquençage. Un pipeline d'analyse des données a été développé, en collaboration avec la plateforme Data Core Analysis de l'Institut du Cerveau, afin de faire l'appel de base, le nettoyage et la sélection des lectures puis leur alignement sur le génome humain. J'ai ensuite mis en place un pipeline d'analyse des lectures déterminant les transcrits alternatifs d'un gène ainsi que ses caractéristiques. Les données seront à terme utilisées pour l'étude de l'expression des gènes impliqués dans les maladies des neurones moteurs, mais j'ai focalisé l'analyse initiale sur un gène en particulier, SPG11, afin de pouvoir mettre en place le protocole ainsi que les pipelines d'analyse. SPG11 est un gène impliqué dans plusieurs maladies des neurones moteurs puisque des mutations de ce gène ont été montrées causales dans des cas de paraplégies spastiques héréditaires, de maladie de Charcot-Marie Tooth et de sclérose latérale amyotrophique. Le transcrit canonique de SPG11 a une taille de 7,8 kb, ce qui en fait un bon candidat pour le développement de ce type de protocole. Grâce à cette étude, j'ai mis en évidence l'existence de transcrits de SPG11 non-décrits dans les bases de données, avec des différences d'expression cellule-spécifique pour certains. Ces transcrits sont prédits codants, ils pourraient donc avoir des fonctions spécifiques dans ces cellules et nous aider à mieux comprendre le rôle général de SPG11. De plus, des fibroblastes prélevés sur des patients mutés dans SPG11 ont également été séquencés. Le but de cette seconde étude, à un stade préliminaire, est de savoir si la variabilité clinique observée chez les patients SPG11 peut être en partie expliquée par un impact des mutations sur l'expression des transcrits alternatifs. Sur le long terme, nous espérons qu'une meilleure compréhension de l'expression du gène aidera à déchiffrer le mécanisme pathologique et à trouver des traitements pour ces pathologies.